APLIKASI METODE PEMISAHAN

KIMIA FARMASI ANALISIS LANJUTAN

APLIKASI METODE PEMISAHAN

  Ummu Choridah Ummah          (14040057)

SEKOLAH TINGGI FARMASI MUHAMMADIYAH TANGERANG

TAHUN AJARAN 2015-2016

Jl. Syekh Nawawi  Km.4  No.13 Matagara, Tangerang - Banten

No. Telp (021) 29867303E-mail: akademik@stfm.ac.id Website: www.stfm.ac.id

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum Wr. Wb.

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan taufik, rahmat dan hidayah-Nya kepada kita semuan sehingga kami dapat menyelesaikan tugas Kimia Farmasi Analisi Lanjutan dengan judul APLIKASI METODE PEMISAHAN dengan baik dan tepat waktu.

Sholawat dan Salam juga kita haturkan kepada junjungan kita, Nabi Muhammad SAW beserta keluarga, sahabat dan pengikut beliau dari dulu hingga akhir zaman

Terima kasih yang tak terhingga penulis sampaikan kepada Bapak Abdul Aziz Setiawan, M. Farm,Apt selaku dosen mata kuliah Kimia Farmasi Analisis Lanjutan karena dengan adanya tugas ini dapat menambah wawasan kami dan kami ucapkan terimakasih kepada semua pihak yang telah membantu sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas ini dengan baik dan tepat waktu. Semoga Allah SWT memberikan balasan  yang berlipat ganda atas jasa-jasa besar mereka.

Kami menyadari sepenuhnya bahwa tugas ini masih jauh dari kesempurnaan, sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun demi kesempurnaan tugas ini. Kami berharap semoga tugas Kimia Farmasi Analisi Lanjutan yang berjudul APLIKASI METODE PEMISAHAN dapat memberikan manfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.

                                                           

                                                                                    Tangerang, Maret 2016

                                                                                                Penulis                                    

BAB I

PENDAHULUAN

A.    Latar Belakang

Dalam Kimia dan teknik kimia, proses pemisahan digunakan untuk mendapatkan dua atau lebih produk yang lebih murni dari suatu campuran senyawa kimia.

Metode pemisahan adalah suatu cara yang digunakan untuk memisahkan atau memurnikan suatu senyawa atau kelompok senyawa yang mempunyai susunan kimia yang berkaitan dari suatu bahan,baik dalam skala laboratorium maupun skala industri. Pada prinsipnya, pemisahan dilakukan untuk memisahkan dua zat atau lebih yang saling bercampur.

Dalam melakukan pemisahan dan pemurnian diperlukan pengetahuan dan keterampilan, terutama jika harus memisahkan komponen dengan kadar yang sangat kecil. Untuk tujuan itu dalam ilmu kimia telah dikembangkan berbagai cara pemisahan sederhana yang sering dilakukan sehari-hari sampai metode pemisahan dan pemurnian kompleks atau tidak sederhana

Ada beberapa jenis metode pemisahan yaitu filtrasi, sublimasi, kristalisasi, destilasi, ekstraksi, adsorbsi dan kromatografi. Salah satunya metode kromatografi yang memberikan cara pemisahan yang paling kuat dilaboratorium kimia. Metode kromatografi karena pemanfaatanya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif.

Tujuan dari pembuatan makalah ini agar kita dapat mengetahui materi mengenai metode pemisahan dan salah satu contoh dari aplikasi metode pemisahan kromatografi kolom dan lapis tipis

B.     Rumusan Masalah

1.    Apa pengertian dari Kromatografi ?

2.    Apa pengertian dari Kromatografi kolom ?

3.    Apa pengertian dari Kromatografi Lapis Tipis ?

4.    Bagimana Analisis Senyawa Metabolit Sekunder Dari Ekstrak Metanol Daun Surian Yang Berpotensi Sebagai Antioksidan dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ?

5.    Bagaimana Modifikasi Teknik Kromatografi Kolom Untuk Pemisahan Trigliserida Dari Ekstrak Buah Merah ?

C.     Tujuan

1.    Untuk menambah ilmu pengetahuan tentang Metode Pemisahan

2.    Untuk mengetahui tentang metode KLT, Ekstraksi, Kromatografi kolom

3.    Untuk mengetahui salah satu contoh aplikasi KLT, Ekstraksi, Kromatografi Kolom

4.    Untuk memenuhi salah satu tugas dari mata kuliah Kimia Farmasi Analisis Lanjutan

D.    Manfaat

1.    Mempermudah memahami lebih dalam mengenai  Metode Pemisahan

2.    Menambah wawasan ilmu pengetahuan tentang Aplikasi Metode Pemisahan

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

1. Pengertian Metode Pemisahan

Metode pemisahan adalah suatu cara yang digunakan untuk memisahkan atau memurnikan suatu senyawa atau kelompok senyawa yang mempunyai susunan kimia yang berkaitan dari suatu bahan,baik dalam skala laboratorium maupun skala industri

2. Jenis-jenis Metode Pemisahan

1.    Top of Form

1.    Filtrasi
Filtrasi atau penyaringan merupakan metode pemisahan untuk memisahkan zat padat dari cairannya dengan menggunakan alat berpori (penyaring). Dasar pemisahan metode ini adalah perbedaan ukuran partikel antara pelarut dan zat terlarutnya. Penyaring akan menahan zat padat yang mempunyai ukuran partikel lebih besar dari pori saringan dan meneruskan pelarut. Proses filtrasi yang dilakukan adalah bahan harus dibuat dalam bentuk larutan atau berwujud cair kemudian disaring. Hasil penyaringan disebut filtrat sedangkan sisa yang tertinggal dipenyaring disebut residu (ampas). Metode ini dimanfaatkan untuk membersihkan air dari sampah pada pengolahan air, menjernihkan preparat kimia di laboratorium, menghilangkan pirogen (pengotor) pada air suntik injeksi dan obat-obat injeksi, dan membersihkan sirup dari kotoran yang ada pada gula. Penyaringan di laboratorium dapat menggunakan kertas saring dan penyaring buchner. Penyaring buchner adalah penyaring yang terbuat dari bahan kaca yang kuat dilengkapi dengan alat penghisap.

2.    Sublimasi
Sublimasi merupakan metode pemisahan campuran dengan menguapkan zat padat tanpa melalui fasa cair terlebih dahulu sehingga kotoran yang tidak menyublim akan tertinggal. bahan-bahan yang menggunakan metode ini adalah bahan yang mudah menyublim, seperti kamfer dan iod.

3.    Kristalisasi
Kristalisasi merupakan metode pemisahan untuk memperoleh zat padat yang terlarut dalam suatu larutan. Dasar metode ini adalah kelarutan bahan dalam suatu pelarut dan perbedaan titik beku. Kristalisasi ada dua cara yaitu kristalisasi penguapan dan kristalisasi pendinginan.
Contoh proses kristalisasi dalam kehidupan sehari-hari adalah pembuatan garam dapur dari air laut. Mula-mula air laut ditampung dalam suatu tambak, kemudian dengan bantuan sinar matahari dibiarkan menguap. Setelah proses penguapan, dihasilkan garam dalam bentuk kasar dan masih bercampur dengan pengotornya, sehingga untuk mendapatkan garam yang bersih diperlukan proses rekristalisasi (pengkristalan kembali) Contoh lain adalah pembuatan gula putih dari tebu. Batang tebu dihancurkan dan diperas untuk diambil sarinya, kemudian diuapkan dengan penguap hampa udara sehingga air tebu tersebut menjadi kental, lewat jenuh, dan terjadi pengkristalan gula. Kristal ini kemudian dikeringkan sehingga diperoleh gula putih atau gula pasir.

4.    Destilasi
Destilasi merupakan metode pemisahan untuk memperoleh suatu bahan yang berwujud cair yang terkotori oleh zat padat atau bahan lain yang mempunyai titik didih yang berbeda. Dasar pemisahan adalah titik didih yang berbeda. Bahan yang dipisahkan dengan metode ini adalah bentuk larutan atau cair, tahan terhadap pemanasan, dan perbedaan titik didihnya tidak terlalu dekat. Proses pemisahan yang dilakukan adalah bahan campuran dipanaskan pada suhu diantara titik didih bahan yang diinginkan. Pelarut bahan yang diinginkan akan menguap, uap dilewatkan pada tabung pengembun (kondensor). Uap yang mencair ditampung dalam wadah. Bahan hasil pada proses ini disebut destilat, sedangkan sisanya disebut residu. Contoh destilasi adalah proses penyulingan minyak bumi, pembuatan minyak kayu putih, dan memurnikan air minum.

5.    Adsorbsi
Adsorbsi merupakan metode pemisahan untuk membersihkan suatu bahan dari pengotornya dengan cara penarikan bahan pengadsorbsi secara kuat sehingga menempel pada permukaan bahan pengadsorbsi. Penggunaan metode ini dipakai untuk memurnikan air dari kotoran renik atau mikroorganisme, memutihkan gula yang berwarna coklat karena terdapat kotoran.

6.    Ekstraksi
Ekstraksi merupakan metode pemisahan dengan melarutkan bahan campuran dalam pelarut yang sesuai. Dasar metode pemisahan ini adalah kelarutan bahan dalam pelarut tertentu.

Ekstraksi adalah jenis pemisahan satu atau beberapa bahan dari suatu padatan atau cairan. Proses ekstraksi bermula dari penggumpalan ekstrak dengan pelarut kemudian terjadi kontak antara bahan dan pelarut sehingga pada bidang datar antarmuka bahan ekstraksi dan pelarut terjadi pengendapan massa dengan cara difusi. Bahan ekstraksi yang telah tercampur dengan pelarut yang telah menembus kapiler-kapiler dalam suatu bahan padat dan melarutkan ekstrak larutan dengan konsentrasi lebih tinggi di bagian dalam bahan ekstraksi dan terjadi difusi yang memacu keseimbangan konsentrasi larutan dengan larutan di luar bahan.

Berdasarkan proses dalam melakukanya. Ekstraksi dapat dibedakan menjadi 3 bagian yaitu :

a.    Ekstraksi cair-cair

b.    Ekstraksi padat-cair

c.    Ekstraksi super kritis

7.    Kromatografi
Kromatografi adalah cara pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan pelarut pada suatu lapisan zat tertentu. Dasar pemisahan metode ini adalah kelarutan dalam pelarut tertentu, daya absorbsi oleh bahan penyerap, dan volatilitas (daya penguapan).

Kromatografi adalah pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan kecepatan zat terlarut yang bergerak bersama-sama dengan pelarutnya pada permukaan benda penyerap. Setiap zat kimia mempunyai kecepatan yang berbeda pada pelarut tertentu. Hal ini disebabkan adanya perbedaan kelarutan setiap jenis zat yang akan dipisahkan. Kromatografi dapat digunakan untuk memisahkan zat-zat penyusun yang terdapat dalam suatu campuran. Pada pemisahan menggunakan metode kromatografi, campuran larutan dilewatkan pada permukaan zat yang tidak reaktif/tidak mudah bereaksi secara kimia (zat inert), seperti silika, alumina, atau kertas khusus. Zat inert adalah fase diam karena zat tidak ikut bergerak bersama campuran. Selain fase diam, terdapat juga fase bergerak. Fase bergerak dapat berupa gas atau cairan. Disebut fase bergerak karena cairan atau gas tersebut akan bergerak bersama-sama campuran melewati permukaan zat inert (fase diam).

a.    Kromatografi terbagi menjadi beberapa jenis, yaitu :

1)   Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas adalah metode pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kelarutan zat-zat dalam pelarut serta, perbedaan penyerapan (adsorbsi) kertas terhadap zat-zat yang akan dipisahkan. Pemisahan dengan cara kromatografi kertas merupakan penerapan konsep gaya antarmolekul, yaitu adhesi dan kohesi. Kromatografi kertas sering dipakai untuk memisahkan zat-zat warna penyusun tinta atau bahan perwarna lainnya.

penyusunnya.

2)   GLC (Gas Liquid Chromatography)

              Diagram Kromatografi Gas

              

GLC merupakan salah satu jenis kromatografi gas yang digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa organik yang mudah menguap. Pada kromatografi ini, fasa gerak yang digunakan adalah gas dan fasa diamnya adalah zat cair. Aplikasi dari kromatografi gas misalnya digunakan untuk menentukan komposisi kimia dari zat-zat yang tidak kita ketahui, seperti misalnya senyawa berbeda dalam bensin. Waktu analisa menggunakan GLC cenderung lebih lama. GLC menggunakan instrumen yang lebih kompleks, beberapa instrumen penting dalam GLC adalah sebagai berikut :

a)    Gas pembawa, merupakan gas yang harus inert dengan sampel dan harus murni. Diantara gas pembawa yang banyak digunakan adalah hidrogen, helium, nitrogen dan argon.

b)   Pengontrol aliran

c)    Injektor atau tempat untuk menyuntikkan sampel

d)   Kolom

e)    Detektor, merupakan instrumen yang berfungsi untuk merupakan sinyal analitik menjadi sinyal listrik.

f)    Rekorder, merupakan instrumen yang akan merubah sinyal listrik menjadi sinyal mekanik agar bisa dibaca dalam bentuk data.

                                     Gambar Instrumen Kromatografi Gas

                           

3)   HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

              Gambar Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

            

Teknik pemisahan HPLC memiliki banyak keunggulan dibanding dengan kromatografi lainnya, diantaranya adalah: cepat dalam proses analisa, resolusi yang lebih tinggi, sensitivitas detektor yang lebih tinggi, kolom yang dipakai dapat digunakan kembali, ideal dan cocok untuk zat bermolekul besar dan berionik dan mudah untuk rekoveri sampel. HPLC boleh dibilang sebagai teknik tercanggih dalam metode kromatografi. HPLC juga menggunakan sistem instrumen seperti pada kromatogarfi gas. Di dalam teknik ini juga digunakan tekanan dan kecepatan yang cukup tinggi sehingga mampu dihasilkan resolusi yang lebih baik

4)   Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom, disebut demikian karena penggunaan kolom gelas pada metode ini. Proses kromatografi kolom yang sering digunakan untuk memisahkan pigmen pada tumbuhan. Campuran pigmen tersebut dimasukkan pada kolom gelas yang berisi aluminia. Pelarut kemudian dialirkan agar membawa campuran melewati kolom. Pigmen akan bergerak turun melewati kolom dengan kecepatan bergantung pada kuat tidaknya adsorpsi pigmen pada aluminia. Pigmen yang teradsorp lemah pada aluminia akan melewati kolom dengan cepat daripada pigmen yang teradsorp kuat. Pigmen ini akan terpisah dan terkumpul pada wadah berbeda saat keluar dari kolom.

5)   Kromatografi lapis tipis

  Gambar Kromatografi Lapis Tipis

             

Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran.

Kromatografi lapis tipis biasanya menggunakan sebuah lempengan tipis yang terbalut gel silika atau alumina. Silika atau alumina tersebut berfungsi sebagai fase diam. Materi lain juga bisa digunakan sebagai fase diam asalkan mampu mengalami pendarflour (fluorescence) dalam sinar ultra violet. Sementara untuk fase gerak yang digunakan adalah pelarut atau campuran pelarut yang digunakan. Aplikasi dari teknik pemisahan kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk mengetahui jenis pada campuran asam amino tertentu. Kromatografi lapis tipis hampir sama dengan metode kromatografi kertas. Perbedaannya terletak pada penggunaan pelat gelas atau plastik pada kromatografi lapis tipis, pelat tersebut dilapisi dengan zat penyerap seperti alumina. Pelarut akan merambat naik memisahkan campuran menjadi zat-zat penyusunnya.

Aplikasi kromatografi lapis tipis (KLT) sangat luas. Senyawa-senyawa yang mudah menguap serta terlalu labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT. Ia dapat pula untuk memeriksa adanya zat pengotor dalam pelarut. Ahli kimia forsenik menggunakan KLT untuk bermacam pemisahan. Pemisahan berguna dari plasticiser, antioksidan, tinta dan formulasi zat perwarna dapat ditentukan dengan KLT. Pemakaiannya juga meluas dalam pemisahan anorganik.

BAB III

PEMBAHASAN

A.    Pengertian Kromatografi

Suatu teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).

Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi pembagian.

B.     Pengertian Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian senyawa dari campuran dengan memakai kolom. Kromatografi kolom termasuk kromatografi preparative.

C.     Pengertian Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran

D.    Analisis Senyawa Metabolit Sekunder Dari Ekstrak Metanol Daun Surian     Yang Berpotensi Sebagai Antioksidan dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

1.         Metode Penelitian

Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi daun surian menggunakan tiga pelarut organik dengan kepolaran yang berbeda, yaitu n-heksan (non-polar), etil asetat (semi polar) dan metanol (polar). Sampel yang digunakan adalah daun surian (T. sureni (Bl.) Merr.) yang diambil dari Kecamatan Wanaraja Garut. Penapisan fitokimia dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder yang terdapat dalam ekstrak metanol. Fase gerak yang digunakan untuk mengelusi sampel divariasikan berdasarkan gradien kepolaran. Pereaksi penampak noda disesuaikan dengan metabolit sekunder yang akan diamati . Dengan metode KLT ini juga dilakukan penapisan aktivitas antioksidan dari masingmasing metabolite sekunder dengan menggunakan perekasi 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Penapisan aktivitas antioksidan ini dilakukan dengan menggunakan asam askorbat sebagai larutan standar.

Uji antioksidan dengan metode peredaman DPPH dilakukan lebih lanjut dengan mengukur sejauh mana reaksi peredaman terhadap radikal bebas DPPH dapat berlangsung. Pengukuran dilakukan secara spektrofotometri dengan mengukur serapan dari masing-masing sampel yang sudah direaksikan dengan larutan standar DPPH 1 mM pada λ 515. Sebagai standar digunakan larutan asam askorbat.

Parameter yang biasa digunakan untuk menginterpretasikan hasil dari uji aktivitas antioksidan dengan peredaman radikal DPPH adalah nilai efficientconcentration (EC50) atau disebut nilai IC50, yakni konsentrasi yang menyebabkan hilangnya 50% aktivitas DPPH. Peredaman radikal DPPH adalah peredaman radikal yang mudah dan akurat dengan kehandalan untuk mengukur kapasitas antioksidan suatu sampel. Peredaman radikal DPPH ini memiliki teknik sederhana, tetapi memiliki kelemahan dalam waktu pengaplikasiannya.

2.         Hasil dan Pembahasan

Hasil Sampel diambil dari Kecamatan Wanaraja Kabupaten Garut Jawa Barat. Pada penelitian ini, 718,9 gram daun surian yang sudah dikeringanginkan dimaserasi dengan pelarut metanol. Ekstrak metanol yang diperoleh dari 3 kali maserasi adalah 186,5 gram dengan rendemen 25,96%. Ekstrak berbentuk cairan kental dan berwarna coklat tua kehijauan. Tehadap ekstrak ini dilakukan penapisan fitokimia dan antioksidan untuk senyawa alkaloid, flavonoid, polifenol dan terpenoid/steroid dengan metode KLT (Tabel 1). Setelah itu dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan peredaman radikal DPPH, sebagai kontrol positif diuji pula asam askorbat (Gambar 2). Analisis aktivitas

Gambar 2. Inhibisi Ekstrak Daun Surian dengan Metode

Peredaman DPPH

 

Antioksidan  memberikan nilai IC50 = 4,80 ppm yangrelatif lebih kecil

dari standar asam askorbat (IC50 = 9,23 ppm).

Pembahasan Proses ekstraksi dengan tiga pelarut memberikan rendemen yang bervariasi untuk setiap pelarut yang digunakan. Dari ketiga ekstrak yang diperoleh dapat dilihat bahwa, ekstrak metanol, merupakan ekstrak yang paling banyak jumlahnya. Hal ini jelas menunjukkan bahwa kandungan senyawa organik polarnya relatif besar, diikuti berturut-turut oleh ekstrak etil asetat (semi polar) dan n-heksan (non-polar).Hasil penapisan fitokimia yang dilakukan dengan metode KLT, diperoleh bahwa ekstrak metanol daun surian (T. sureni, (Bl.) Merr) positif mengandung alkaloid, flavonoid, dan juga polifenol (Tabel 1).

Uji aktivitas antioksidan dari ekstrak daun surian (T.sureni, Bl. (Merr)) dilakukan melalui reaksi peredaman radikal 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Radikal bebas dikenal sebagai faktor utama dalam kerusakan biologi, dan DPPH digunakan untuk mengevaluasi aktivitas peredaman radikal bebas dari suatu antioksidan alami. DPPH yang merupakan suatu molekul radikal bebas dengan warna ungu dapat berubah menjadi senyawa yang stabil dengan warna kuning oleh reaksi dengan antioksidan, dimana antioksidan memberikan satu elektronnya pada DPPH sehingga terjadi peredaman pada radikal bebas DPPH. Uji DPPH merupakan metode yang mudah untuk menapis sejumlah kecil molekul antioksidan karena reaksi dapat diamati secara visual menggunakan KLT, atau juga intensitasnya dapat dianalisis melalui spektrofotometri sederhana. Struktur DPPH dan reaksinya dengan antioksidan ditunjukkan pada Gambar 3.

Elektron tak berpasangan pada DPPH memberikan suatu absorbsi yang kuat, maksimum pada λ = 517 nm dan berwarna ungu. Peredaman radikal bebas olehantioksidan terjadi ketika elektron tak berpasangan menjadi berpasangan dengan adanya sebuah donor hidrogen, sehingga membentuk DPPH yang lebih stabil.

Gambar 3. Mekanisme DPPH Akseptor

Aktivitas peredaman radikal bebas biasanya dinyatakansebagai persen inhibisi dari DPPH, tetapi dapat juga dinyatakan sebagai konsentrasi yang menyebabkan hilangnya 50% aktivitas DPPH (IC50). Nilai IC50 dianggap sebagai ukuran yang baik dari efisiensiantioksidan senyawa-senyawa murni ataupun ekstrak[12].

Persentase inhibisi tertinggi dari ekstrak asam askorbat dan ekstrak metanol adalah 96% dan 94%. Persentase ini menunjukkan bahwa aktivitas DPPH sudah hilang sebesar 96% pada asam askorbat 20 ppm dan 94% pada ekstrak metanol 20 ppm. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol mampu meredam radikal DPPH, dankekuatan peredamannya relatif lebih baik dibandingkan standar asam askorbat. Kemampuan peredaman radikal DPPH pada ekstrak metanol terutama terjadi pada metabolit sekunder alkaloid (Rf = 0,937) dan polifenol (Rf = 0,833 dan 0,449). Hal ini terkait erat dari bentuk struktur kedua metabolit tersebut.

Pada senyawa polifenol, aktivitas antioksidan berkaitan erat dengan struktur rantai samping dan juga substitusi pada cincin aromatiknya. Kemampuannya untuk bereaksi dengan radikal bebas DPPH dapat mempengaruhi urutan kekuatan antioksidannya. Aktivitas peredaman radikal bebas senyawa polifenol diyakini dipengaruhi oleh jumlah dan posisi hidrogen fenolik dalam molekulnya. Dengan demikian aktivitas antioksidan yang lebih tinggi akan dihasilkan pada senyawa fenolik yang mempunyai jumlah gugus hidroksil yang lebih banyak pada inti flavonoidnya.

Senyawa fenolik ini mempunyai kemampuan untuk menyumbangkan hidrogen, maka aktivitas antioksidan senyawa fenolik dapat dihasilkan pada reaksi netralisasi radikal bebas yang mengawali proses oksidasi atau pada penghentian reaksi radikal berantai yang terjadi.

Sifat antioksidan dari flavonoid berasal dari kemampuan untuk mentransfer sebuah elektron ke senyawa radikal bebas (Gambar 4) dan juga membentuk kompleks dengan logam (Gambar 5). Kedua mekanisme itu membuat flavonoid memiliki beberapa efek, diantaranya menghambat peroksidasi lipid, menekan kerusakan jaringan oleh radikal bebas dan menghambat aktivitas beberapa enzim.

Senyawa alkaloid, terutama indol, memiliki kemampuan untuk menghentikan reaksi rantai radikal bebas secara efisien. Senyawa radikal turunan dari senyawa amina ini memiliki tahap terminasi yang sangat lama (Gambar 6).

Beberapa senyawa alkaloid lain yang bersifat antioksidan adalah quinolon , kafein yang dapat bertindak sebagai peredam radikal hidroksil dan melatonin yang berperan penting menjaga sel dari pengaruh radiasi dan toksisitas obat-obatan. Namun dalam penelitian ini belum dapat diketahui jenisa lkaloid apa yang berperan dalam bioaktivitas antioksidan.

Gambar 4. Peredaman Radikal Bebas oleh Flavonoid.(A) Struktur Dasar Flavonoid . (B) Proses Peredaman Radikal Bebas oleh Flavonoid.

Gambar 5. Pembentukan Kompleks Logam pada Flavanoid

Gambar 6. Peredaman Radikal Bebas oleh Alkaloid

Sementara itu dari data persen inhibisi yang diperoleh(Gambar 2) didapatkan nilai IC50 untuk ekstrak metanol daun surian (T. sureni (Bl.) Merr) adalah 4,80 ppm sedangkan asam askorbaat adalah 9,23 ppm. Nilai IC50 dari ekstrak metanol daun surian yang relatif lebih kecil ini menunjukkan bahwa aktivitas antioksidannya relatif lebih besar dibandingkan larutan standar asam askorbat.

E.   Modifikasi Teknik Kromatografi Kolom Untuk Pemisahan Trigliserida Dari Ekstrak Buah Merah

1.         Metode Penelitian

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimen kualitatif di laboratorium kimia. Penelitian pendahuluan berupa penentuan perbandingan eluen dan fasa diam yang digunakan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Kemudian ekstrak buah merah dipisahkan dengan menggunakan kolom kromatografi. Kolom kromatografi dan plat KLT yang digunakan telah dimodifikasi fasa diamnya yaitu dengan menambahkan alumina dan mangan dioksida (MnO2) kedalam silika gel. Eluen yang digunakan adalah campuran petroleum eter – dietil eter. Hasil pemisahan diidentifikasi dengan spektroskopi infra merah (IR), spektroskopi 1H-NMR dan Gas Chromatography – Mass Spectroscopy (GC-MS).

2.         Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Dasar Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan Sublab Kimia Laboratorium Pusat Universitas Sebelas Maret Surakarta. Sedangkan identifikasi dilakukan di Laboratorium Kimia Organik Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.Waktu kegiatan penelitian berlangsung pada bulan Juli 2009 – April 2010.

3.         Alat dan Bahan yang Digunakan

a.    Alat

1)        GC-MS QP2010S Shimadzu

2)        1H-NMR JEOL-MY60

3)        IR Shimadzu FTIR Prestige 21

4)         TLC Plate Coater

5)         TLC Chamber

6)         Kolom Kromatografi Teka

7)         Lampu UV 254 nm

8)        Peralatan Gelas.

b.    Bahan

1)        Ekstrak buah merah produksi I Made Budi

2)        Silica Gel 60 GF254 for TLC (E.Merck)

3)        Aluminiumoxid 150 basisch (Typ T) (alumina untuk KLT) (E.Merck)

4)        Silica Gel 60 (0.063 – 0.200 mm) (E.Merck)

5)        Aluminiumoxid 60 active basisch (aktivitatsstufe I) (alumina untuk kromatografi kolom) (E.Merck)

6)        Plat TLC Silica Gel 60 F254 (E.Merck)

7)         MnO2 (E.Merck)

8)        Dietil eter p.a. (E.Merck)

9)         Petroleum eter p.a. (E.Merck)

10)     Rhodamin B

11)     Aquades

4.         Prosedur Penelitian

a.    Penentuan Eluen dan Fasa Diam dengan KLT

Sejumlah adsorben yang akan digunakan untuk pelapis dibuat bubur dengan sejumlah pelarut. Adsorben yang digunakan sebagai fasa diam adalah silika gel yang ditambahkan dengan alumina dengan perbandingan silika gel – alumina sebesar 2:3 serta dengan penambahan MnO2 masing-masing sebanyak 3% dan 5% dari berat total fasa diam. Terlebih dulu silika gel diaktivasi dengan pemanasan pada suhu 110 – 125 oC sedangkan alumina diaktivasi pada suhu 125 – 150 oC selama beberapa jam.

Campuran fasa diam kemudian dibuat bubur dengan menggunakan aquades dan diratakan pada plat kaca dengan menggunakan alat TLC Plate Coater. Setelah adsorben pada plat kaca rata, plat lapis tipis yang terbentuk didiamkan selama 30 menit dan dikeringkan dalam oven pada suhu 100 – 120 oC selama 1 jam. Plat yang telah kering didinginkan dan disimpan dalam desikator.

Ekstrak buah merah ditotolkan pada plat KLT modifikasi (silika gel : alumina, 2 :3, dan MnO2) yang telah dibuat. Sebagai pembandingnya, ekstrak buah merah juga ditotolkan pada plat TLC silica gel 60 F254 dan plat KLT dengan fasa diam silika gel:alumina (2:3). Masing-masing plat kemudian dielusikan dengan menggunakan larutan pengembang berupa petroleum eter:dietil eter dengan perbandingan 7:3, 3:2, dan 1:1. Untuk mengidentifikasi adanya spot lipida pada plat modifikasi, plat yang telah dielusi dikeringkan, kemudian disemprot dengan 0,5% rhodamin B dalam etanol dan diletakkan dibawah sinar UV. Spot yang akan tampak adalah spot berwarna kuning atau berwarna ungu kebiruan ketika dilihat dibawah sinar UV.

b.    Pembuatan Kolom Kromatografi

Fasa diam yang digunakan sebagai adsorben dalam kolom adalah silika gel yang dimodifikasi dengan penambahan alumina (silika gel : alumina, 2:3) dan MnO2 3%. Sebelumnya silika gel diaktivasi dengan pemanasan pada suhu 110 – 125 oC sedangkan alumina diaktivasi pada suhu 125 – 150 oC selama 24 jam.

Campuran adsorben dimasukkan kedalam kolom dalam keadaan kering, dimana sebelumnya kolom telah diisi dengan pelarut petroleum eter hingga mencapai setengah panjang kolom. Campuran adsorben dimasukkan ke dalam kolom tiap 3 gram untuk menghasilkan lapisan-lapisan fasa diam. Keran pada kolom dibiarkan terbuka agar pelarut dapat keluar. Kemudian kolom dikeringkan dari pelarut hingga mencapai 1 cm batas atas permukaan fasa diam.

c.    Pemisahan dengan Kolom Kromatografi

Sampel berupa ekstrak buah merah dimasukkan kedalam kolom dan dibiarkan terserap kedalam fasa diam. Teknik elusi yang digunakan adalah teknik elusi gradien menggunakan petroleum eter:dietil eter dengan perbandingan eluen dimulai dari 7:3, 3:2 dan 1:1. Eluat yang dihasilkan kemudian ditampung dalam vial-vial tiap 2 mL dan dikeringkan dari pelarutnya.

Eluat yang telah kering dari pelarut atau eluen kemudian ditimbang dan diuji dengan KLT. Nilai Rf yang dihasilkan dibandingkan dengan nilai Rf dari plat KLT silika gel awal. Nilai Rf yang sama dikumpulkan kemudian fraksi yang dihasilkan diidentifikasi dengan menggunakan IR, 1H-NMR dan GC-MS.

5.         Hasil Penelitian dan Pembahasan

a.    Penentuan Eluen dan Fasa Diam dengan KLT

Pemisahan trigliserida dari ekstrak buah merah menggunakan modifikasi teknik kromatografi kolom diawali dengan penentuan komposisi fasa diam dan eluen yang akan digunakan. Penentuan ini dilakukan dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Eluen yang akan digunakan dalam kromatografi kolom ditentukan dengan menggunakan plat TLC silica gel 60 F254. Eluen yang digunakan adalah campuran petroleum eter dan dietil eter dengan perbandingan 19:1, 7:3, 3:2, 1:1, 2:3, dan 3:7. Perbandingan eluen yang akan digunakan ditentukan dari jumlah spot yang dihasilkan. Spot yang dihasilkan dari plat KLT mengalami tailing. Hal ini dikarenakan ekstrak buah merah berbentuk minyak yang sangat pekat. Pemisahan dengan jumlah spot yang lebih banyak didapat adalah dengan menggunakan perbandingan eluen 7:3 (5 spot), 3:2 (6 spot), dan 1:1 (5 spot) (tabel 5). Tabel 5.Harga Rfdari Spot Hasil Pemisahan Ekstrak Buah Merah

Fasa diam dalam teknik modifikasi kromatografi kolom adalah silika gel yang dicampur dengan alumina. Alumina yang digunakan adalah alumina basa yang mendekati pH 10. Untuk mengetahui pengaruh dari alumina dalam fasa diam tersebut terhadap hasil pemisahan, maka dilakukan pemisahan dengan menggunakan campuran fasa diam silka gel:alumina. Perbandingan campuran silika gel dan alumina yang digunakan adalah 2:3. Eluen yang digunakan dalam pemisahan ini adalah campuran eluen petroleum eter dan dietil eter dengan perbandingan yang didapat dari pemisahan dengan menggunakan plat silika gel yaitu 7:3. Hasil pemisahan dengan dapat dilihat pada tabel 5.

Pemisahan dengan menggunakan fasa diam silika gel menghasilkan 5 – 6 spot untuk tiap perbandingan eluen. Jumlah spot berwarna merah pada eluen 7:3 lebih banyak dibandingkan dengan eluen lainnya. Trigliserida dan beta-karoten merupakan senyawa non-polar yang saling bercampur satu sama lain. Kedua senyawa tersebut dapat larut dalam eluen petroleum dan dietil eter. Pada perbandingan eluen 7:3, trigliserida diduga telah terpisah dari asam lemak bebas, namun karena perbandingan eluen yang sifatnya kurang polar sehingga beta-karoten masih bercampur dengan kedua komponen tersebut. Sehingga pemisahan antara trigliserida dengan asam lemak tidak terlihat jelas. Namun, ketika perbandingan eluen ditingkatkan sehingga menjadikan eluen bersifat lebih polar, terdapat spot berwarna kuning yang telah terpisah dari beta-karoten yang diindikasikan sebagai asam lemak bebas.

Alumina yang ada dalam fasa diam silika gel mengakibatkan spot yang dihasilkan menjadi lebih sedikit dibandingkan dengan menggunakan plat silika gel. Alumina merupakan fasa diam yang bersifat polar. Jika alumina dicampur dengan silika yang juga bersifat polar, maka sifat polar dari fasa diam akan semakin kuat. Hal ini mengakibatkan senyawa-senyawa dalam ekstrak buah merah yang bersifat polar akan semakin tertahan didalam fasa diam sedangkan senyawa non polar akan terelusi lebih cepat. Akibatnya adalah ada beberapa spot yang tampak pada plat silika gel terkumpul menjadi satu spot pada plat silika gel:alumina. Selain itu juga, warna yang dihasilkan dari tiap spot menunjukkan bahwa dalam tiap spot masih terdapat beta-karoten walaupun warna untuk spot pertama lebih pudar. Alumina dapat menyerap senyawa karotenoid. Hal ini dapat mengakibatkan beta-karoten akan lebih tertahan dalam fasa diam.

Teknik modifikasi kromatografi kolom juga menggunakan oksidator berupa MnO2 dalam campuran fasa diam silika gel : alumina. Modifikasi teknik KLT menggunakan fasa diam yang sama untuk ekstrak lipida memerlukan oksidator MnO2 sebesar 0,5% untuk dapat memisahkan lipida sebagai senyawa turunannya (Handayani, 2008). Sedangkan bila menggunakan ekstrak beta-karoten membutuhkan oksidator sebanyak 5% untuk dapat mengubah senyawa beta-karoten tersebut (Rumanthi, 2008).

Gambar 6. Hasil Elusi Ekstrak Buah Merah dengan Plat Modifikasi KLT Si:Al (1) dan Si:Al + MnO2 3% (2)

Ekstrak buah merah mengandung berbagai macam senyawa seperti trigliserida, beta-karoten dan tokoferol, sehingga harus dicari komposisi oksidator yang sesuai agar dapat memisahkan trigliserida dari senyawa-senyawa lainnya. Komposisi oksidator yang digunakan adalah 3% dan 5% dari berat total fasa diam. Hasil pemisahan dari fasa diam modifikasi yaitu terdiri dari silika gel:alumina dengan penambahan MnO2 3% yang dibandingkan dengan hasil pemisahan dengan plat silika gel:alumina dapat dilihat pada gambar 6. Sedangkan untuk perbandingan hasil pemisahan trigliserida dari ekstrak buah merah menggunakan komposisi MnO2 3% dan 5% dapat dilihat pada tabel 6.

MnO2 didalam campuran fasa diam silika gel dan alumina dapat menyebabkan perubahan pada pemisahan yang dihasilkan. Pada spot a telah terbebas dari beta-karoten yang artinya beta-karoten telah bereaksi dengan oksidator yang menyebabkan beta-karoten berubah dan terpisah dari trigliserida. Spot a dapat diidentifikasi dengan disemprot dengan menggunakan rhodamin B dan dilihat dengan menggunakan lampu UV. Rhodamin B adalah reagen yang digunakan untuk menguji adanya trigliserida dan asam lemak (Jork, 1990). Dengan demikian, spot pertama dan ketiga pada plat modifikasi merupakan senyawa trigliserida dan asam lemak.Tabel 6. Harga Rf dari Spot Hasil Pemisahan dengan Silika Gel : Alumina+ MnO2

Komposisi oksidator MnO2 yang semakin banyak pada campuran fasa diam, mengakibatkan perubahan yang cukup signifikan pada beta-karoten. Spot berwarna merah muda pada plat yang menggunakan MnO2 5% tidak muncul bila dibandingkan dengan plat dengan MnO2 3%. Warna merah pada spot yang merupakan warna dari beta-karoten pada plat MnO2 5% hanya ditunjukkan oleh satu spot saja. Pada plat MnO2 3% terdapat dua spot untuk beta-karoten yaitu spot merah dan merah muda. Sehingga hanya dengan menggunakan komposisi MnO2 sebanyak 3% dari berat fasa diam, sudah dapat memisahkan lipida dari senyawa lain dalam ekstrak buah merah seperti beta-karoten.

Berdasarkan penentuan eluen dan komposisi fasa diam, kemudian dilakukan pemisahan trigliserida dari ekstrak buah merah dengan menggunakan alumina dengan penambahan MnO2 sebesar 3% dengan eluen berupa campuran petroleum eter dan dietil eter dengan perbandingan 7:3, 3:2, dan 1:1.

b.    Pemisahan dengan Kolom Kromatografi

Kolom kromatografi yang digunakan adalah kolom yang telah dimodifikasi dengan menggunakan fasa diam silika gel - alumina (2:3) ditambahkan dengan MnO2 3%. Kolom modifikasi ini dibuat dengan metode kering yaitu dengan memasukkan campuran fasa diam kedalam kolom yang telah berisi pelarut. Campuran tersebut tidak dibuburkan terlebih dulu, tetapi langsung dimasukkan dalam keadaan kering. Penggunaan metode kering dikarenakan ukuran dari partikel MnO2 yang lebih kecil dibandingkan dengan silika gel dan alumina mengakibatkan MnO2 selalu berada diatas sehingga tidak dapat bercampur sempurna (homogen). Selain itu, berat dari MnO2 lebih ringan dibandingkan dengan silika gel dan alumina sehingga bila fasa diam dimasukkan kedalam kolom, MnO2 akan selalu tertinggal paling atas. teknik modifikasi kromatografi kolom. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel :

                                   

Gambar 7. Modifikasi Kolom Kromatografi

Kondisi fasa diam yang sulit untuk bercampur (homogen) mengharuskan Kondisi fasa diam yang sulit untuk bercampur (homogen) mengharuskan untuk menggunakan suatu teknik yang dapat membuat fasa diam hampir mendekati homogen seperti pada plat modifikasi KLT. Teknik yang digunakan adalah memasukkan campuran fasa diam sedikit demi sedikit. Fasa diam yang akan terbentuk adalah fasa diam yang membentuk lapisan-lapisan seperti pada gambar 7. Dengan teknik ini, fasa diam yang dihasilkan hampir mendekati homogen sama seperti pada KLT modifikasi. Data-data mengenai kolom kromatografi modifikasi yang dihasilkan dapat dilihat pada lampiran 1.

Eluen yang digunakan adalah petroleum eter dan dietil eter dengan perbandingan 7:3, 3:2, dan 1:1. Teknik elusi yang digunakan adalah teknik elusi gradien yaitu dimulai dari perbandingan petroleum eter:dietil eter sebesar 7:3. Kolom yang digunakan disini adalah kromatografi kolom tekan, sehingga kecepatan alir dari eluen dapat diatur. Dalam pemisahan dengan kolom modifikasi ini, kecepatan alir yang digunakan sekecil mungkin yang artinya bahwa elusi yang terjadi berjalan lambat. Hal ini bertujuan untuk memaksimalkan pemisahan dan reaksi yang terjadi antara fasa diam kolom modifikasi dengan sampel. Ketika menggunakan kecepatan alir yang kecil, tekanan didalam semakin besar, sehingga pemisahan yang terjadi menjadi lebih baik.

Ekstrak buah merah diletakkan didalam kolom dan dibiarkan terjerap kedalam fasa diam terlebih dulu sebelum dilakukan elusi. Pada saat pengelusian yang terjadi adalah fraksi berwarna merah terpisah lebih dulu yang merupakan campuran trigliserida, asam lemak dengan beta-karoten. Setelah elusi berlangsung lebih lama, warna merah dari beta-karoten kemudian sedikit demi sedikit menjadi pudar. Ini menandakan bahwa beta-karoten sudah mulai bereaksi dengan fasa diam. Kemudian terbentuk pemisahan berwarna kuning setelahnya dan lama-kelamaan warna-warna dari pemisahan-pemisahan tersebut menjadi hilang secara keseluruhan.

Tabel 7.Fraksi yang Dihasilkan dari Modifikasi Kolom   Kromatografi

Eluat yang ditampung tidak berwarna. Untuk mempermudah dalam pengidentifikasian, tiap eluat ditampung didalam vial sebanyak 2 mL. Kemudian eluat-eluat tersebut diuapkan dari pelarutnya dan ditimbang serta diuji dengan menggunakan plat KLT silika gel. Eluen yang digunakan adalah petroleum eter dan dietil eter dengan perbandingan 3:2. Berat yang didapat dari fraksi yang dihasilkan dapat dilihat pada gambar 8 sedangkan harga Rf dari tiap fraksi dapat dilihat pada tabel 7.

Gambar 8. Diagram Berat Eluat Pemisahan Kromatografi Kolom Diagram berat eluat dari pemisahan kolom modifikasi menghasilkan dua puncak yang kemudian eluat yang membentuk kedua puncak tersebut dikumpulkan menjadi satu sehingga didapat dua fraksi. Sedangkan untuk harga Rf dari eluat disesuaikan dengan harga Rf pada plat KLT silika gel awal dengan eluen yang sama. Perbandingan Rf eluat dengan Rf pada plat silika gel awal dapat dilihat pada gambar 9. Eluat dengan harga Rf yang sama kemudian dikumpulkan menjadi satu sehingga didapat dua fraksi. Fraksi yang didapat dari hasil diagram berat dan harga Rf adalah dua fraksi dengan kumpulan vial yang sama.

Fraksi pertama yang dihasilkan berbentuk cairan seperti minyak berwarna kuning muda bening sedangkan fraksi ketiga berwarna kuning tua. Wujud dan warna dari fraksi pertama menunjukkan bahwa fraksi tersebut merupakan senyawa trigliserida. Sedangkan fraksi ketiga yang berwarna kuning merupakan senyawa asam lemak. Fraksi kedua dan keempat tidak menunjukkan adanya spot pada pengujian dengan KLT. Dari diagram berat fraksi juga menunjukkan bahwa fraksi tersebut telah habis. Fraksi kedua dan keempat merupakan beta-karoten yang telah habis bereaksi dengan oksidator sehingga tidak terdeteksi dengan menggunakan plat KLT.

Gambar 9. Perbandingan Rf Plat Silika Gel Awal dengan Rf dari Eluat

Penggunaan kolom kromatografi tekan dengan kecepatan alir yang lambat mengakibatkan beta-karoten bereaksi dengan sempurna dengan MnO2. Hal ini dibuktikan dengan tidak adanya beta-karoten pada eluat-eluat yang ditampung. Yang terjadi adalah beta-karoten yang kontak dengan MnO2 mengalami reaksi dan menghasilkan suatu produk oksidasi. Produk tersebut kemudian kontak dengan udara yang dihasilkan oleh aerator pada kolom kromatografi tekan atau terkena sinar sehingga mengakibatkan produk tersebut menjadi rusak dan hilang. Pada saat penampungan eluat, dikarenakan eluat yang berwarna bening, sehingga ada eluat yang tidak tertampung diawal. Eluat tersebut diberi tanda sebagai eluat vial ke-0 (nol). Berat dari eluat yang telah diuapkan pada vial tersebut adalah 439 mg dan harga Rf dari eluat tersebut adalah 0,96 sehingga vial ke-0 tersebut dikumpulkan dengan fraksi pertama. Total berat dari fraksi pertama adalah 733 mg.

Fraksi pertama dari kolom kromatografi modifikasi berbentuk cairan kuning bening diindikasikan sebagai trigliserida. Kemudian fraksi tersebut diidentifikasi kandungan senyawanya dengan menggunakan IR, 1H-NMR dan GC-MS. Hal ini didasari dari pertimbangan bahwa fraksi pertama yang merupakan trigliserida, bersama-sama dengan beta-karoten dan senyawa-senyawa lain dalam ekstrak buah merah, mengalami kontak pertama kali dengan fasa diam modifikasi dan kemudian terpisah lebih dulu dari dalam kolom sehingga dapat diketahui pengaruh dari oksidator MnO2 terhadap senyawa trigliserida tersebut. Selain itu pertimbangan lainnya adalah bahwa fraksi pertama memiliki berat yang cukup banyak untuk dapat dilakukan identifikasi lebih lanjut.

c.       PengaruhAlumina dan MnO2

pemisahan menggunakan KLT dengan fasa diam berupa silika gel:alumina menyebabkan trigliserida dapat terpisah dengan baik dari beta-karoten. Walaupun ada sebagian dari beta-karoten yang masih bercampur dengan trigliserida. Penambahan MnO2 pada fasa diam silika gel:alumina menyebabkan sebagian beta-karoten yang bercampur dengan trigliserida mengalami perubahan dan akhirnya trigliserida terbebas dari beta-karoten.

Pengaruh alumina pada pemisahan dengan menggunakan kolom kromatografi yang telah dimodifikasi tidak dapat diketahui. Namun pengaruh dari adanya oksidator MnO2 dalam fasa diam sangat jelas terlihat. Hal tersebut terlihat ketika elusi telah mencapai ¼ panjang kolom yaitu dengan adanya degradasi warna dari sampel ekstrak buah merah. Semula sampel berwarna merah pekat, setelah beberapa saat warna tersebut mulai pudar dan akhirnya menghilang.

Kolom kromatografi modifikasi merupakan suatu sistem alir besar yang mempunyai suatu oksidator dan katalis basa dalam fasa diam. Sampel ekstrak buah merah adalah suatu bahan yang mengandung trigliserida, tokoferol dan beta-karoten. Asam lemak berikatan rangkap yang merupakan penyusun rantai trigliserida dapat mengalami oksidasi, beta-karoten juga dapat mengalami reaksi oksidasi sekaligus dapat mencegah oksidasi dari asam lemak, sedangkan tokoferol mencegah oksidasi dari beta-karoten dan trigliserida. Kemungkinan yang terjadi adalah trigliserida, tokoferol dan beta-karoten melewati sistem dibawa oleh eluen secara bersama-sama. Senyawa-senyawa tersebut bertemu dengan oksidator, sehingga terjadi kompetisi antara trigliserida, tokoferol dan beta-karoten untuk bereaksi dengan oksidator.

MnO2 merupakan suatu agen pengoksidasi yaitu dapat mengoksidasi senyawa tertentu dengan mendonorkan oksigennya atau menerima elektron dari senyawa lain. Dengan adanya alumina sebagai katalis basa yang mempunyai atom oksigen dengan muatan yang tinggi serta pH mendekati 10, diduga dapat meningkatkan aktivitas dari MnO2 sebagai oksidator yaitu dengan memberikan elektronnya pada MnO2 sehingga MnO2 dapat dengan mudah melepaskan oksigennya. Aktivitas dari oksidator yang semakin kuat dapat dengan mudah mengoksidasi ikatan rangkap. Beta-karoten yang mengandung ikatan rangkap lebih banyak akan bereaksi terlebih dulu dengan oksidator dibandingkan dengan trigliserida. Hal ini ditunjukkan dari warna sampel yang semakin menghilang selama elusi. Ketika beta-karoten telah habis bereaksi dengan oksidator, trigliserida akan bereaksi dengan oksidator yang tersisa dalam kolom. Namun, reaksi oksidasi tersebut akan dihalangi oleh tokoferol yang juga merupakan suatu antioksidan. Sehingga trigliserida akan terlindungi sampai elusi selesai. Hal ini ditunjukkan dengan hasil identifikasi yang menyatakan bahwa senyawa yang dihasilkan dari pemisahan dengan kolom adalah suatu trigliserida. Kandungan beta-karoten didalam ekstrak buah merah ±300 ppm. Perbandingan antara beta-karoten yang bereaksi dengan oksidator adalah kurang lebih 1:129. Hasil perhitungan dapat dilihat pada lampiran 4.

Hasil yang diperoleh dari penelitian ini menunjukkan bahwa dengan menggunakan modifikasi fasa diam dalam kromatografi yaitu berupa penambahan suatu oksidator dan alumina kedalam silika gel, akan didapatkan suatu senyawa berupa trigliserida yang terpisah dari senyawa-senyawa lain yang ada didalam sampel melalui suatu reaksi oksidasi.

d.   Pengaruh Antioksidan Terhadap Asam Lemak

Asam lemak tak jenuh dan senyawa antioksidan mempunyai hubungan yang saling berkaitan. Ikatan rangkap dari asam lemak sangat mudah teroksidasi dan membentuk radikal bebas berupa peroksida asam lemak. Didalam tubuh, peroksida tersebut dapat mengakibatkan terjadinya penyakit. Berdasarkan penelitian ini, dengan adanya senyawa antioksidan, trigliserida yang dilewatkan dalam suatu sistem pengoksidasi dapat dipisahkan tanpa merusak atau mengoksidasi asam lemak tak jenuh dalam trigliserida tersebut. Antioksidan melindungi asam lemak tak jenuh dari oksidator dengan mengorbankan dirinya untuk bereaksi dengan oksidator. Namun, bila jumlah oksidator melebihi senyawa antioksidan yang dapat bereaksi dengan oksidator tersebut, akan mengakibatkan asam lemak menjadi tidak terlindungi dari reaksi oksidasi. Senyawa dioktil phtalat yang didapat bersama-sama dengan trigliserida dari hasil pemisahan, diindikasikan sebagai produk hasil dari oksidasi asam lemak tak jenuh setelah antioksidan habis bereaksi dengan oksidator. Penelitian terhadap ekstrak lipida dengan sistem pengoksidasi telah dilakukan Handayani (2008). Lipida yang dilewatkan melalui sistem yang mengandung oksidator mengakibatkan senyawa dioktil phtalat yang dihasilkan semakin banyak. Selain senyawa tersebut, juga didapat senyawa lain yaitu berupa senyawa bis(2-etilheksil)adipat. Tidak adanya senyawa antioksidan bersama dengan lipida menjadikan lipida sangat mudah teroksidasi. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, bila asam lemak dikonsumsi langsung tanpa adanya senyawa antioksidan, memiliki kemungkinan yang cukup besar untuk dapat menyebabkan asam lemak teroksidasi menjadi radikal bebas.

KESIMPULAN

Metode pemisahan adalah suatu cara yang digunakan untuk memisahkan atau memurnikan suatu senyawa atau kelompok senyawa yang mempunyai susunan kimia yang berkaitan dari suatu bahan,baik dalam skala laboratorium maupun skala industri. Pada prinsipnya, pemisahan dilakukan untuk memisahkan dua zat atau lebih yang saling bercampur.

Kromatografi ialah Suatu teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).

Kesimpulan dari metode kromatografi lapis tipis Ekstrak metanol daun surian yang diperoleh mempunyai rendemen 25,96%. Ekstrak metanol yang relatif lebih banyak dibandingkan ekstrak etil asetat maupun nheksan. Hal ini menunjukkan bahwa kandungan senyawa polar pada daun surian (T. sureni (Bl.) Merr) relatif lebih banyak dibandingkan senyawa non polar.

Dari hasil uji peredaman 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) diketahui bahwa ekstrak metanol memberikannilai positif terhadap uji DPPH, dengan nilai IC50 4,8 ppm, yang relatif lebih baik dari asam askorbat (IC50 = 9,23 ppm). Aktivitas antioksidan ini disebabkan adanya kandungan alkaloid dan polifenol yang dapat meredam radikal DPPH dengan cara mentransfer elektron ke senyawa radikal bebas DPPH. Untuk mengetahui lebih jauh aktivitas antioksidan dari ekstrak metanol daun surian (T. sureni (Bl.) Merr) ini disarankan untuk melakukan fraksinasi dan isolasi sehingga dapat diketahui zat-zat yang aktif sebagai antioksidan.

Kesimpulan Dari hasil penelitian dan pembahasan sebelumnya dapat diambil kesimpulan bahwa senyawa trigliserida dapat dipisahkan dari senyawa-senyawa lain yang ada dalam ekstrak buah merah menggunakan modifikasi teknik kromatografi kolom yaitu dengan menambahkan alumina dan agen pengoksidasi berupa MnO2 kedalam silika gel. Senyawa antioksidan dalam ekstrak buah merah akan melindungi trigliserida agar tidak rusak atau teroksidasi selama proses elusi berlangsung menggunakan modifikasi fasa diam tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim.2015.Kromatografi Keretas Lapis Tipis Kolom dan Gas

http://www.pengertianahli.com/2015/04/kromatografi-kertas-lapis-tipis-kolom-gas.html Diakses pada tanggal 3 April 2016

icheanindita.2012.Kromatografi Kolom

http://icheanindita.blogspot.co.id/2012/05/kromatografi-kolom.html Diakses pada tanggal 3 April 2016

Anonim.2012.Pengertian Ekstraksi dan Macam-macam Jenis Ekstraksi

http://www.anak-farmasi.com/2012/07/pengertian-ekstraksi-dan-macam-macam-jenis-ekstraksi Diakses pada tanggal 3 April 2016

Anonim.2013.Kromatografi Kolom.

http://www.Ilmukimia.org/2013/05/kromatografi-kolom.html?m=1 Diakses pada tanggal 3 april 2016